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Servicios Científico Técnicos – Proteómica

El SCT de Proteómica tiene como principal objetivo proporcionar soporte científico-tecnológico a la comunidad investigadora en el análisis de proteínas y otras biomoléculas, mediante el uso de la espectrometría de masas. Las técnicas actualmente implementadas en el servicio permiten realizar estudios de expresión diferencial de proteínas (DIGE, etc), estudios de proteómica dirigida para cuantificación de proteínas (SRM) e identificación de proteínas, entre otros. Además, ofrecemos la posibilidad de cuantificar ciertos metabolitos.

Prestamos apoyo a la comunidad científica ofreciendo una infraestructura completa dentro del campo de la Proteómica.

Nuestro trabajo incluye:

  • El asesoramiento de proyectos
  • Diseño experimental
  • Procesado de muestras con la tecnología de la unidad
  • Interpretación de resultados
  • Soporte en la presentación y escritura de resultados para publicación

 

Servicios
Técnicas
Separación de proteínas mediante técnicas de electroforesis mono- y/o bi-dimensional

Posibilidad de realizar el servicio como autousuario, siempre que se demuestre experiencia en estas técnicas:

  • Separación de proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (1D)
  • Separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D) (7, 18 y 24 cm)
  • Cortado automático de spots
  • Tinción de geles con coomassie o plata
  • Escaneado fluorescente (Typhoon) y no fluorescente (GS-800)
  • Escaneado de Western Blot por infrarrojos (Odyssey CLx)
Identificación de proteínas por espectrometría de masa
  • Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas MALDI-TOF y TOF/TOF
  • Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas LC-ESI-MS/MS
  • Identificación de proteínas en mezclas complejas por LC-ESI-MS/MS
Expresión diferencial de proteínas mediante DIGE (differential in-gel electrophoresis)
Determinación de masa de proteínas y péptidos por espectrometría de masas (MALDITOF)
Expresión diferencial e identificación de proteínas por iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation)
Cuantificación de proteínas conocidas por nano LC-ESI-MS/MS (técnica MRM)ion)
Cuantificación de esteroles (HPLC-4000QTRAP)
Uso de espectrofotómetro-luminómetro-fluorímetro (autoservicio)
Precipitación de proteínas
Cuantificación de proteína total por ensayo colorimétrico
Aplicaciones
Expresión diferencial de proteínas

Uno de los aspectos claves en investigación biomédica es poder identificar y cuantificar las variaciones a nivel de expresión de proteínas entre individuos sanos y enfermos, y a su vez los cambios observados durante los diferentes estadios de la patología con el fin de descubrir biomarcadores de pronóstico o diagnóstico. En este sentido, ofrecemos tres aproximaciones diferentes:

  1. Electroforesis bidimensional (2D): las proteínas se separan según su punto isoeléctrico y peso molecular en un gel de poliacrilamida. Estos geles se tiñen y se digitalizan en un escáner. El análisis cuantitativo se realiza comparando las intensidades de cada mancha o “spot” para cada muestra problema mediante un software de análisis de imagen.  
  2. Electroforesis diferencial en gel (DIGE): las proteínas se separan en geles de poliacrilamida igual que en la 2D, pero se realiza un marcaje de las proteínas de cada muestra previo a su separación, con una de las tres sondas fluorescentes disponibles (Cy2, Cy3 y Cy5). Esto permite que en cada gel se analicen 2 muestras simultáneamente lo que mejora la reproducibilidad del análisis. La digitalización se debe realizar en un escáner de fluorescencia (Typhoon).
  3. Isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ): esta última aproximación no utiliza geles de poliacrilamida sino que las proteínas de cada muestra se digieren con una enzima (tripsina generalmente) y se realiza un marcaje a nivel de péptido. Cada muestra se marca con un tag diferente (hay hasta 8 tags), una vez marcadas, las muestras se combinan y se analizan por cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Mediante los espectros de MS/MS se consigue, por un lado, la identificación de las proteínas presentes mediante la búsqueda en bases de datos y por otro lado, el análisis semi-cuantitativo de las mismas por comparación de las intensidades relativas de los iones reportero. Variaciones en dichas intensidades se traducen en una variación en los niveles de la proteína que dio lugar a dicho péptido.
Cuantificación de proteínas conocidas

La validación de los potenciales biomarcadores descubiertos en la fase de screening es uno de los principales retos de la investigación biomédica. Para ello es necesario disponer de herramientas que permitan la cuantificación de manera precisa de aquellas proteínas de interés en diferentes muestras biológicas.

El servicio de Proteómica ofrece la técnica Multiple Reaction Monitoring (MRM). En esta técnica, la cuantificación se realiza a nivel de péptido por lo que primero las proteínas de cada muestra serán digeridas con una enzima (generalmente tripsina). Posteriormente los péptidos se separan en un equipo de LC y se introducen secuencialmente en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QQQ). Desde un punto de vista instrumental, en un análisis MRM típico Q1 transmite a Q2 una sola masa (m1), correspondiente al péptido tríptico completo. En Q2 se fragmenta ese péptido en fragmentos más pequeños (m2, m3, m4, etc). Q3 opera de forma que sólo transmite algunos de dichos fragmentos (por ejemplo m2, m3). Esas transiciones (m1 a m2 y m1 a m3), generan unos picos cromatográficos que en función de su intensidad relativa podrán cuantificar cambios a nivel de abundancia proteica. Para cuantificar será necesario la compra de péptidos sintéticos marcados isotópicamente.

Podemos destacar como principales aplicaciones de la técnica de MRM:

  • Validación de los biomarcadores encontrados en la fase de screening
  • Cuantificación de proteínas conocidas sin necesidad de anticuerpo
  • Cuantificación de proteínas con modificaciones postraduccionales
  • Cuantificación de proteínas mutadas
  • Cuantificación de isoformas
Cuantificación de metabolitos conocidos

La cuantificación de metabolitos es igualmente interesante en la búsqueda de biomarcadores de pronóstico o diagnóstico en biomedicina. En este caso la molécula diana no será una proteína sino una molécula pequeña.

En el Servicio de Proteómica ofrecemos la posibilidad de desarrollar y validar métodos analíticos para la cuantificación de determinados metabolitos. Posteriormente, usaremos esos métodos analíticos para cuantificar aquellos metabolitos en muestras de interés. Para ello utilizaremos la técnica de MRM y el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 4000QTRAP acoplado a un HPLC analítico. Para poder realizar la cuantificación será necesario la compra de los estándares de las moléculas de interés así como sus estándares internos (normalmente la misma molécula marcada isotópicamente).

Equipamiento
Espectrometría de masas
  • 4800plus MALDI-TOF/TOF (ABSciex)
  • 4000QTRAP (AB), Tempo-Nano MDLC (AB) y HPLC 1200 RRLC (Agilent)
  • Software: Mascot Daemon (MatrixScience), ProteinPilot (AB), Multiquant (AB), Markerview (AB) y Skyline (UW)
Electroforesis mono-bidimensional y DIGE
  • Enfoque isoeléctrico: Protean IEF (Bio-Rad) (7,18 y 25 cm)
  • SDS-PAGE: Protean plus dodeca (Bio-Rad), Mini-protean plus dodeca (Bio-Rad) y mini-protean (Bio-Rad)
  • Imagen:
    • Densitiometer GS-800 (Bio-Rad)
    • Typhoon Trio (GE)
    • Odyssey CLx (Li-cor)
  • Software: SameSpots (Progenesis), QuantityOne (Bio-Rad), PDQuest (Bio-Rad)
  • Cortador automático de spots ExQuest (Bio-Rad)
  • Digestor automático de proteínas MSI Complete (Intavis)
Investigación en el SCT
El SCT de Proteómica del IACS forma parte de la Plataforma de Recursos Biomoleculares y Bioinformáticos Programa de Proteómica (ISCIII AES-2013-PRB2) del Instituto de Salud Carlos III.
Participación en proyectos de investigación
  • Proyecto Spanish Human Proteome Project Chr 16 Consortium (SpHPP). Iniciativa englobada en el Human Proteome Project (HPP) y en la Plataforma de Recursos Biomoleculares y Bioinformáticos Programa de Proteómica (ISCIII AES-2013-PRB2).
Publicaciones y congresos
  • A multicentric study to evaluate the use of relative retention times in targeted proteomics. Vialas V, Colomé-Calls N, Abian J, Aloria K, Alvarez-Llamas G, Antúnez O, Arizmendi J, Azkargorta M, Barceló-Batllori S, Barderas M, Blanco F, Casal JI, Casas V, de la Torre C, Chicano-Gálvez E, Elortza F, Espadas G, Estanyol JM, Fernandez-Irigoyen J, Fernandez-Puente P, Fidalgo MJ, Fuentes M, Gay M, Gil C, Hainard A, Hernaez ML, Ibarrola N, Kopylov A, Lario A, Lopez JA, López-Lucendo M,  Marcilla M, Marina-Ramírez A, Marko-Varga G, Martín L, Mora MI, Morato-López E, Muñoz J, Odena MA, Oliveira E, Orera I, Ortea I, Pasquarello C, Ray KV, Rezeli M, Ruppen I, Sabidó E, Sanchez del Pino M, Sancho J, Santamaría E, Vazquez J, Vilaseca M, Vivanco F, Walters JJ, Zgoda V, Corrales F, Canals F, Paradela A. Journal of Proteomics (2017) 152, 138–149
  • Identification of bitter pit protein markers in Malus domestica using differential in-gel electrophoresis (DIGE) and LC–MS/MS. Krawitzky M, Orera I, Lopez-Millan  AF, Oria R, Val J. Postharvest Biology and Technology  (2016) 111, 224–23
  • The proteomic 2D-DIGE approach reveals the protein voltage-dependent anion channel 2 as a potential therapeutic target in epithelial thyroid tumours. Mato E, Barceló-Batllori S, Orera I, Selva L, Corra M, González C, Bell O, Lerma E, Moral A, Pérez JI, de Leiva A. Molecular and Cellular Endocrinology  (2015) 404, 37–45
  • Surfing Transcriptomic Landscapes. A Step beyond the Annotation of Chromosome 16 Proteome. Segura V., Medina-Aunon JA, Mora MI, Martínez-Bartolomé S, Abian J, Aloria K, Antúnez O, . Arizmendi JM, Azkargorta M, Barceló-Batllori S, Beaskoetxea J, Bech-Serra J,  Blanco F, Monteiro MB,Cáceres D, Canals F, Carrascal M, Casal JI, Clemente F, Colomé N,  Dasilva N, Díaz P, Elortza F, Fernández-Puente P, Fuentes M, Gallardo O, Gharbi SI,  Gil C, González-Tejedo C,  Hernáez ML, Lombardía M, Lopez-Lucendo M, Marcilla M, Mato JM, Mendes M, Oliveira E, Orera I et al. Journal of Proteome Research. (2014), 13, 158−172.
  • Simultaneous Determination of Oxysterols, Phytosterols and Cholesterol Precursors by High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry in Serum. Baila-Rueda L., Cenarro A., Cofán M., Orera I., Barceló S., Pocovi M., Ros E., Civeira F., Nerin C., Domeño C. Analytical Methods (2013), 5, 2249-2257
  • Proteomic profile of osteoclasts in Gaucher disease patients according to the severity of bone manifestations. Irún P, Pocoví M, Orera I, Giraldo P. World Lysosomal Symposium. 2015, Orlando, USA
  • Targeting proteins of chromosome 16. Odriozola L, Colomé N, Canals F,  Hernáez ML, Clemente F, Gil C, Fernández P, Ruiz C, Orera I, Barceló S, Marcilla M, Gharbi S, Vivanco F, Sabido E, Pérez E, Sánchez del Pino M, Fernández J, Albar JP, Corrales FJ.  13th Human Proteome Organization World Congress. 2014, Madrid, Spain.
  •  Disecting chromosome 16 Proteome.  Corrales FJ. , Gil C, Blanco F, Sánchez del Pino MM, Vazquez J., Muñoz J, Santamaria E, Elortza F, Oliveira E, Canals F, Pascual-Montano A, Arizmendi JM, Estanyol JM, Barceló S, Orera I, Gonzalez-Bardenas M, Sancho J, Vivanco F, Fuentes M, Sabidó E.  13th Human Proteome Organization World Congress. 2014, Madrid, Spain.
  •  Two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) Proteomic Analysis in epithelial human thyroid carcinoma identified voltage-dependent anion channel 2 protein (VDAC2) as an apoptotic key factor. Mato E, Selva L, Corra M, Barceló S, Orera I, González C, Bell O, Moral A, Pérez J I, de Leiva A. 2nd World Congress on Thyroid Cancer (2nd WCTC). 2013, Toronto, Canadá.
  • Development of SRM methods for the detection and quantification of chromosome 16 proteins. Mora MI, Colomé N, Canals F, Clemente F, Gil C, Fernández P, Ruiz C, Orera I, Barceló S, Marcilla M, Albar JP, Corrales FJ, SpHPPchromosome16Consortium. 12th Human Proteome Organization World Congress, 2013, Yokohama, Japan.
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