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SCT – Animalario – Transgénesis

Servicios destinados fundamentalmente a la producción de ratones modificados genéticamente y su conservación. El objetivo es modificar el genoma murino para desentrañar los mecanismos genéticos, moleculares, celulares y fisiológicos que subyacen en los procesos biológicos en un organismo complejo.

La aportación de los animales transgénicos en el estudio del desarrollo animal ha sido espectacular, dado el grado de conservación y similitud de los mecanismos básicos que gobiernan el desarrollo de los organismos, a pesar de la extraordinaria diversidad en morfología y tamaño. Muchas otras áreas como la inmunología, la oncología o la neurobiología, por citar solo algunas, se han beneficiado igualmente del caudal de conocimientos básicos generados haciendo uso de esta tecnología, de tal forma que resulta impensable ahora situarse en la frontera de avance de estas disciplinas sin su concurso.

En la práctica, los animales transgénicos están siendo utilizados para crear modelos animales de enfermedades humanas que posibilitan el estudio detallado de la patogénesis y en último término, el diseño y ensayo de nuevos procedimientos diagnósticos, terapéuticos y preventivos.

Además de la generación de transgénicos, entre otras de nuestras funciones se encuentra, la criopreservación de líneas de ratón, estudios de desarrollo embrionario preimplantacional, estudios de reproducción y rederivación sanitaria de líneas de ratón.

La Unidad se creó sobre la base del trabajo previo realizado por el Dr. Pedro Muniesa, cuya colaboración y asesoría del continúan siendo fundamentales.

Ofrecemos servicios para

Modificación del genoma del ratón
Criopreservación de líneas de ratón modificados genéticamente, facilitando su intercambio, importación y exportación
Rederivación y mejora del estatus sanitario de líneas de ratón
Estudios de desarrollo embrionario, estudios de reproducción y microcirugía embrionaria entre otros. En colaboración con la Unidad de Cultivo Celular, se ofrecen la derivación de células ES y obtención de cultivos primarios de células de ratón

Para el desarrollo de nuestro trabajo contamos con personal acreditado y especializado en ciencias del animal de laboratorio y se cuenta con la autorización legal para la realización de los siguientes procedimientos de experimentación entre otros:

Obtención de embriones preimplantacionales de ratón
Transferencia de embriones de ratón
Vasectomía en ratón
Obtención de fibroblastos primarios de embriones de ratón (MEFs)
Obtención de esperma en ratón

Servicios

Transgénesis

Los modelos de ratón modificados genéticamente se han convertido en una herramienta clave tanto en investigación básica como en investigación biomédica, gracias a la capacidad de controlar la expresión de los genes que estamos estudiando. De esta manera, es posible aumentar, disminuir e incluso eliminar la expresión de un gen completamente. También, se puede regular la expresión del gen en estudio, es decir “apagarlo o encenderlo” en el tiempo, o en el sitio de expresión (transgenesis condicional e inducible).

Generación de ratones transgénicos por microinyección de DNA en Pronúcleo

El procedimiento consiste en la microinyección de una solución de DNA de la construcción génica, en el pronúcleo de embriones en fase de una célula. Aunque presenta algunos inconvenientes (sitio de integración aleatorio, integración de múltiples copias de la construcción génica en tandem, etc.), es una de las técnicas más comúnmente utilizadas para la producción de animales transgénicos.

Producción de quimeras de ratón para generación de líneas Knock-Out (KO) y Knock-In (KI) (Transgénesis dirigida o Gene Targetting)

La Transgénesis dirigida (Gene Targetting) supone la modificación de un gen determinado o un lugar específico del genoma gracias a la utilización de procedimientos de recombinación homóloga en líneas de células ES. Estas células se introducen en embriones, o bien se agregan a estos para generar nuevos individuos que permitan su transmisión por línea germinal. Este servicio se puede realizar con las siguientes técnicas:

Inyección de células ES en embriones de 8 células
Inyección de células ES en blastocistos
Agregación de células ES con embriones de 8 células/mórula

Servicios de almacenamiento de líneas de ratón (criopreservación)

Criopreservación de embriones

La criopreservación de embriones proporciona un depósito de larga duración de las líneas de ratón. Es un seguro de protección frente a problemas de cría, enfermedades infecciosas, mutaciones genéticas, catástrofes o pérdidas totales. En el corto tiempo que llevamos trabajando hemos recuperado dos líneas que habían tenido dos de estos problemas gracias a que teníamos animales criopreservados. Asimismo, mejora la eficiencia de los métodos de rederivación porque no es necesario expandir la colonia y además, facilita el intercambio de animales a nivel mundial.

Criopreservación de esperma

La criopreservación de esperma se utiliza para archivar también las líneas de ratón. Es más barato que la criopreservación de embriones, pero solo se preserva la mitad de la información (hemicigosis) por lo que debe asegurarse que se podrá recuperar la línea usando ovocitos de hembras wild-type de la misma cepa o línea.

Envío de líneas de ratón

Existen diferentes maneras de enviar líneas de ratones a nivel local, nacional e internacional, sin necesidad de transportar animales vivos, lo que resulta más económico y evita tramitar solicitudes, permisos, etc. La Unidad de Transgénesis ofrece asesoramiento, asistencia y apoyo metodológico sobre el modo de realizar los envíos de líneas de animales tomando en consideración las necesidades individuales de cada caso. El investigador debe ponerse en contacto con la UT con la suficiente antelación para una correcta organización del envío.

Recepción de líneas de ratón

Existen repositorios de líneas de ratón y rata modificados genéticamente a nivel mundial donde se pueden encontrar modelos animales criopreservados. La Unidad de Transgénesis ofrece asistencia al investigador para encontrar y acoger cualquier modelo de su interés que se encuentre disponible en cualquier lugar del mundo, almacenado en cualquiera de sus formas criopreservadas. En el caso de que un investigador pretenda obtener alguna línea, debe tenerse en cuenta que es necesario proporcionar tanto el protocolo de congelación como el protocolo de descongelación de dicha línea.

Mantenimiento de líneas en nitrógeno líquido

Disponemos de dewars Taylor-Warton para el mantenimiento de las líneas en N2 líquido.

Rederivación de líneas de ratón para obtener animales SPF (Sepecific Pathogen Free)

A menudo, las cepas o líneas de ratón que están alojadas en instalaciones convencionales, pueden infectarse con diferentes patógenos. Estas infecciones que no manifiestan sintomatología o signos clínicos, puede influir considerablemente en los resultados de los procedimientos experimentales, causando una gran pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo.

La rederivación, “limpieza” o descontaminación de una línea de ratón infectada, se lleva a cabo mediante superovulación de hembras, cruce con machos y recogida de embriones. Los embriones, después de una serie de lavados se transfieren al tracto reproductivo de hembras pseudopreñadas SPF. Todas las líneas se pueden rederivar, pero la eficiencia del procedimiento depende de la respuesta hormonal, que es un rasgo característico de cada línea.

La rederivación de animales que provienen de otras instituciones, constituye el método más seguro para proteger, por un lado, a las colonias de nuestro centro de una posible rotura de barrera, y por otro lado, a los investigadores de una mala interpretación de sus resultados.

Derivación de células ES

Las células madre embrionarias (ES) son células madre pluripotentes que se obtienen a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto. Pueden dar origen a las tres hojas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo) incluida la línea germinal, pudiendo así, generar todos los tipos celulares. Por el contrario, las células madre adultas son multipotentes siendo capaces solamente de producir un número limitado de tipos celulares. Además, bajo condiciones definidas, las células madre embrionarias se propagan indefinidamente, por lo que suponen una herramienta muy útil tanto en investigación como en medicina regenerativa. Las enfermedades que, potencialmente, se podrían tratar con células madre pluripotentes incluyen enfermedades genéticas, cánceres, desordenes, etc, relacionados con el sistema inmune y hematopoyético, diabetes juvenil, o neurodegenerativas como el Parkinson y daños de la médula espinal, entre otros.

Otros usos potenciales de las células madre embrionarias son estudios de desarrollo embrionario, estudios de enfermedades genéticas y ensayos de toxicología.

Estudios de desarrollo embrionario preimplantacional

Sobreexpresión (DNA, RNA) temporal

Knock down (siRNA y dsRNA) temporal

En estudios de desarrollo embrionario, podemos provocar una sobreexpresión temporal de nuestro gen de interés gracias a la microinyección pronuclear de DNA o citoplasmática de RNA. De la misma manera, se puede producir un silenciamiento (una reducción de la expresión del gen diana) si utilizamos moléculas relacionadas con el RNA de interferencia: siRNA (small interfiring RNA) y dsRNA (double-stranded RNA).

Fecundación in vitro(FIV)

Se superovulan (Superovulación) hembras del fondo genético adecuado, con el fin de obtener ovocitos. Se extrae esperma de los vasos deferentes y epidídimo de machos. Se incuban juntos y los que se fecunden y alcancen el estadio de dos células, se implantan quirúrgicamente en el oviducto de una hembra receptora (transferencia embrionaria).

La FIV se utiliza mayoritariamente para recuperar líneas a partir de esperma congelado. (criopreservación de esperma). Asimismo, la podemos usar para recuperar líneas de gran valor cuyas hembras presentan problemas de fertilidad. También, cuando hay impedimentos físicos o de comportamiento que complican el apareamiento o cuando no hay machos suficientes o espacio adecuado para la monta natural. Una utilidad interesante de esta técnica es la producción de un gran número de animales de la misma edad en un solo paso, utilizando esperma extraído de un solo macho. Puede ser una opción para introducir animales en el animalario y/o realizar una rederivación sanitaria. En investigación, también se utiliza para evaluar la calidad espermática en ratones transgénicos, apreciar el anclaje de los espermatozoides a la zona pelúcida y para la valoración de las consecuencias de la utilización de espermatozoides con diferentes alteraciones en el desarrollo embrionario y en animales producidos mediante FIV.

Estudios de reproducción

Gracias a las técnicas que manejamos en la unidad , tales como Superovulación, Manejo y cultivo de embriones,Procedimientos quirúrgicos relacionados con el aparato reproductor, Fecundación in vitro, etc, podemos asesorar, apoyar ,asistir y realizar cualquier estudio según las necesidades del investigador.

Superovulación

La superovulación es una técnica rutinaria en transgénesis que se utiliza para la obtención de un gran número de ovocitos o embriones preimplantacionales a partir del mínimo número de animales. Asimismo, sincroniza el ciclo estral de las hembras que se utilizan, favoreciendo así, el diseño experimental. Se utilizan hembras de de 3-12 semanas de edad, obteniéndose mejores resultados en hembras de 3-4 y de 6-10 semanas de edad. El tratamiento consiste en la administración de hormonas: Una dosis de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) y una dosis de hCG (Human Chorionic Gonadotropin) transcurridas 46-48 h. Si lo que necesitamos son embriones, estas hembras se cruzarán con machos mayores de 8 semanas de edad y que sean reproductores comprobados. Al día siguiente se separan las parejas y se recogen los embriones ese mismo día o en días posteriores dependiendo del estadio que se requiera. Hay que tener en cuenta que cada línea de ratón posee una diferente respuesta hormonal.

Obtención, manejo y cultivo de embriones

La obtención y el manejo de los embriones requieren de unas herramientas específicas y una destreza en el manejo de estas adquirida con la práctica. Calcular el número de embriones y su calidad puede ser útil en estudios de reproducción o para caracterizar líneas generadas de las que no se tenga información. Los embriones son la materia prima en estudios de desarrollo embrionario por lo que si se trabaja en este campo es imprescindible la adquisición de esta habilidad en el manejo y en cultivo.

Procedimientos quirúrgicos

Para los procedimientos quirúrgicos contamos con un estereomicroscopio de cirugía Leica M80, con pantalla acoplada para covisualización y cámara IC80HD para la toma de fotografías y videos. Además, contamos con un Estereomicroscopio Leica M205C con estativo diascópico y luz fría acoplada de Leds al que se le acopla la misma cámara muy fácilmente. Las cirugías se realizan bajo anestesia inhalatoria. Rutinariamente, realizamos este tipo de cirugías pero podemos amoldarnos a las necesidades del investigador. En un futuro este equipamiento se encontrará en la zona SPF del animalario, pudiéndose utilizar en autoservicio.

Transferencia embrionaria

La transferencia embrionaria es una técnica crucial para la generación de animales transgénicos, (link) rederivación de líneas contaminadas y la revitalización de líneas criopreservadas, además de ser un elemento clave en las técnicas de reproducción asistida (Fecundación in vitro)) Introducimos quirúrgicamente los embriones en el aparato reproductor de hembras de acogida, para su desarrollo y ulterior nacimiento.

Vasectomías

Al ser el ratón un animal de ovulación inducida, necesita de la cópula para iniciar la gestación. Con el fin de generar hembras receptoras que gesten los embriones para las transferencias embrionarias, contamos con una colonia de machos a los que hemos esterilizado quirúrgicamente utilizando este método.

Trasplante de ovarios

La técnica consiste en la ablación quirúrgica de los ovarios de una hembra incapacitada y su trasplante dentro de la bolsa ovárica de una hembra receptora.

Trasplante de espermatogonias

El trasplante de espermatogonias constituye un método alternativo para la generación de animales transgénicos. Las ventajas sobre las técnicas tradicionales incluyen una disminución del tiempo y del número de animales necesarios para la obtención de descendencia transgénica. Se modifican genéticamente células precursoras de espermatogónias y se introducen en el testículo de machos esterilizados químicamente para que desarrollen espermatozoides con la información genética y la transmitan a su descendencia. Esta técnica comenzó a desarrollarse en la Unidad dentro de un proyecto de investigación. Para llevarla a cabo contamos con un microinyector programable con compresor integrado Femtojet de Eppendorf.

Microcirugía embrionaria

También, tenemos el equipamiento necesario para realizar inmunocirugía y derivación mecánica por micromanipulación con microcuchilla ultraafilada. (Laura P O’Neill el al.) Lo que intentamos con estas técnicas es aislar la masa celular interna de un blastocisto, conformada por las células que van a desarrollar el organismo propiamente dicho, de las células del trofoectodermo que formaran las estructuras placentarias, y así, dilucidar los mecanismos que entrañan la diferenciación de estos dos tipos celulares.

Obtención de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)

Estamos autorizados legalmente para la realización de este procedimiento de experimentación. Junto con la línea celular de fibroblastos de ratón STO son una de las clases de feeders que más se utilizan. Las “feeders” conforman una matriz de soporte y una capa de células alimentadoras que gracias a una combinación de interacciones moleculares de superficie y de secreciones de factores de señalización solubles, ayudan al mantenimiento de las ES en un estado de crecimiento indiferenciado. La desventaja de utilizar MEFs es que tienen una vida limitada en cultivo y deben reponerse continuamente de stocks congelados, pero esto no conlleva ningún problema, ya que, solamente, se debe llevar a cabo este procedimiento una vez al año o menos, incluso, para establecer un stock de células. Una vez obtenidos los MEFs, se pasan a la Unidad de Cultivos Celulares para que los inactiven, los congelen y los utilicen. Además de servir como feeders, los MEFs se utilizan tb para validar dianas farmacológicas, en ensayos de screenings toxicológicos y para evaluar construcciones de expresión de genes. Además, podemos asesorar, realizar, asistir y dar apoyo para la obtención de cualquier otro cultivo primario que el investigador requiera para sus estudios.

Equipamiento

Equipo de anestesia inhalatoria para ratón.

Estereomicroscopio de fluorescencia Leica M165FC

con estativo diascópico, revolver de objetivos PlanApo 2x y 1x y filtros para GFP, TXR, DXR y UV, cámara digital software y monitor para covisualización y documentación científica.
Se trata de una lupa con fluorescencia para la observación y la realización de fotografías de alta resolución. Pudiéndose utilizar tanto con luz transmitida como con luz incidente.

Estereomicroscopio Leica M205C

con estativo diascópico y luz fría acoplada de Leds, con cámara Leica IC80HD para covisualización, realización de vídeos y documentación científica.

Estereomicroscopio Leica M80 de cirugía

con cámara Leica IC80HD para covisualización, realización de vídeos y documentación científica.

Microscopio invertido Nikon Eclipse TE 2000-S

Lleva acoplados:

1 microinyector programable con compresor integrado Femtojet de Eppendorf.
2 micromanipuladores hidráulicos de tipo joystick, Narishige MO-188NE
1 manipulador macro motorizados de tipo joystick , Narishige MM-188NE
1 microinyector de circuito de aire Cell Tram Air de Eppendorf

Estirador automático de capilares de vidrio Sutter P-97 para fabricación de micropipetas

Este equipo sirve para estirar capilares de vidrio para la fabricación de todo tipo de micropipetas. Las micropipetas se utilizan en transgénesis para realizar microinyección pronuclear, microinyección citoplasmática, Inyección de células ES e ICSI (IntraCitoplasmatic Sperm Injection). También, se utilizan en estudios de electrofisiología para la fabricación de microelectrodos extracelulares e intracelulares y “patch clamps” y en estudios donde se microinyectan células adherentes, C. elegans, Drosophila, Zebrafish, embriones de Xenopus, etc., Pero se pueden fabricar diferentes tipos de pipetas según las necesidades

Otros equipos

Microinyector de circuito de aceite Cell Tram Oil de Eppendorf.
Microinyector programables con compresor integrado Femtojet de Eppendorf.
Perforador piezoeléctrico de pulsos mecánicos longitudinales Prime-Tech PMM-150FU.
Incubador de CO2 MiniGalaxy A, RSBiotech.
Incubador de CO2 C60 Labotect.
Dewars Taylor-Warton para la conservación de líneas en N2.
Cabina de seguridad biológica Telstar MOD. BIO-II-A.