Proteómica

Identificación de proteínas por espectrometría de masas

• • Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas MALDI-TOF y TOF/TOF
  • Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas LC-ESI-MS/MS
  • Identificación de proteínas en mezclas complejas por LC-ESI-MS/MS

Determinación de masa de proteínas y péptidos por espectrometría de masas MALDITOF

Cuantificación relativa de proteínas sin marcaje (label free) por espectrometría de masas de alta resolución

Cuantificación dirigida de proteínas por LC-ESI-MS/MS (técnica MRM)

Cuantificación dirigida de metabolitos por HPLC-MS/MS (técnica MRM):

• • Esteroles en suero
  • 7-ketocolesterol en plasma
  • Glucosilesfingosina (LysoGB1) en plasma
  • c-di-AMP en extractos bacterianos

Separación de proteínas mediante técnicas de electroforesis mono- y/o bi-dimensional

Posibilidad de realizar el servicio como autousuario, siempre que se demuestre experiencia en estas técnicas:

• • Separación de proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (1D)
  • Separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D) (7, 18 y 24 cm)
  • Cortado automático de spots
  • Tinción de geles con coomassie o plata
  • Escaneado fluorescente (Typhoon) y no fluorescente (GS-800)
  • Escaneado de Western Blot por infrarrojos (Odyssey CLx)

Precipitación de proteínas

Desalado y concentración de proteínas

Cuantificación de proteína total por ensayo colorimétrico

Expresión diferencial de proteínas

Uno de los aspectos claves en investigación biomédica es poder identificar y cuantificar las variaciones a nivel de expresión de proteínas entre individuos sanos y enfermos, y a su vez los cambios observados durante los diferentes estadios de la patología con el fin de descubrir biomarcadores de pronóstico o diagnóstico.

Para este tipo de estudios recomendamos la técnica de cuantificación relativa de proteínas sin marcaje (label free) por espectrometría de masas de alta resolución.

En esta técnica las proteínas de cada muestra se digieren con una enzima (tripsina generalmente). Los péptidos resultantes se analizan por cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. La identificación de las proteínas se realiza mediante los espectros de MS/MS y la cuantificación relativa se realiza según la intensidad de los péptidos en el espectro de MS. Variaciones en dichas intensidades se traducen en una variación en los niveles de la proteína que dio lugar a dicho péptido.

Cuantificación dirigida de proteínas

La validación de los potenciales biomarcadores descubiertos en la fase anterior de expresión diferencial es uno de los principales retos de la investigación biomédica. Para ello es necesario disponer de herramientas que permitan la cuantificación de manera precisa de aquellas proteínas de interés en diferentes muestras biológicas.

El servicio de Proteómica ofrece la técnica Multiple Reaction Monitoring (MRM). En esta técnica, la cuantificación se realiza a nivel de péptido por lo que primero las proteínas de cada muestra serán digeridas con una enzima (generalmente tripsina). Posteriormente los péptidos se separan en un equipo de LC y se introducen secuencialmente en el espectrómetro de masas 6500QTRAP+. Desde un punto de vista instrumental, en un análisis MRM típico el primer cuadrupolo Q1 transmite a Q2 una sola masa (m1), correspondiente al péptido tríptico completo. En Q2 se fragmenta ese péptido en fragmentos más pequeños (m2, m3, m4, etc). El tercer cuadrupolo Q3 opera de forma que sólo transmite algunos de dichos fragmentos (por ejemplo, m2, m3). Esas transiciones (m1 a m2 y m1 a m3), generan unos picos cromatográficos que, en función de su intensidad relativa, podrán cuantificar cambios a nivel de abundancia proteica. Para cuantificar puede ser necesario la compra de péptidos sintéticos marcados isotópicamente.

Podemos destacar como principales aplicaciones de la técnica de MRM:

• Validación de los biomarcadores
• Cuantificación de proteínas sin necesidad de anticuerpo
• Cuantificación de proteínas con modificaciones postraduccionales
• Cuantificación de proteínas mutadas
• Cuantificación de isoformas

Cuantificación de metabolitos conocidos

La cuantificación de metabolitos es igualmente interesante en la búsqueda de biomarcadores de pronóstico o diagnóstico en biomedicina. En este caso la molécula diana no será una proteína sino una molécula pequeña.

En el Servicio de Proteómica ofrecemos la posibilidad de desarrollar y validar métodos analíticos para la cuantificación de determinados metabolitos. Posteriormente, usaremos esos métodos analíticos para cuantificar aquellos metabolitos en muestras de interés. Para ello utilizaremos la técnica de MRM explicada anteriormente y el espectrómetro de masas 6500QTRAP+ acoplado a un HPLC analítico. Para poder realizar la cuantificación será necesario la compra de los estándares de las moléculas de interés, así como sus estándares internos (normalmente la misma molécula marcada isotópicamente).

• 6500QTRAP+ (Sciex), HPLC nano/micro LC425 (Sciex) y HPLC 1200 (Agilent)
• 4800plus MALDI-TOF/TOF (Sciex)
• Software: Mascot Daemon (MatrixScience), Multiquant (Sciex) y Skyline (UW)

• Enfoque isoeléctrico: Protean IEF (Bio-Rad) (7,18 y 25 cm)
• SDS-PAGE: Protean plus dodeca (Bio-Rad), Mini-protean plus dodeca (Bio-Rad) y mini-protean (Bio-Rad)
• Densitiometer GS-800 (Bio-Rad)
• Typhoon Trio (GE)
• Odyssey CLx (Li-cor)
• Software: SameSpots (Progenesis), QuantityOne (Bio-Rad), PDQuest (Bio-Rad)
• Cortador automático de spots ExQuest (Bio-Rad)
• Digestor automático de proteínas MSI Complete (Intavis)

• Proyecto Spanish Human Proteome Project Chr 16 Consortium (SpHPP). Iniciativa englobada en el Human Proteome Project (HPP) y en la Plataforma de Recursos Biomoleculares. Programa de Proteómica (ISCIII AES-2017-PRB3).

• Proyecto Spanish Human Proteome Project Chr 16 Consortium (SpHPP). Iniciativa englobada en el Human Proteome Project (HPP) y en la Plataforma de Recursos Biomoleculares. Programa de Proteómica (ISCIII AES-2017-PRB3).