Servicios

• Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas MALDI-TOF y TOF/TOF
• Identificación de proteínas aisladas por espectrometría de masas LC-ESI-MS/MS
• Identificación de proteínas en mezclas complejas por LC-ESI-MS/MS

• Esteroles en suero
• 7-ketocolesterol en plasma
• Glucosilesfingosina (LysoGB1) en plasma
• c-di-AMP en extractos bacterianos

• Separación de proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (1D)
• Separación de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D) (7, 18 y 24 cm)
• Cortado automático de spots
• Tinción de geles con coomassie o plata
• Escaneado fluorescente (Typhoon) y no fluorescente (GS-800)
• Escaneado de Western Blot por infrarrojos (Odyssey CLx)

Uno de los aspectos claves en investigación biomédica es poder identificar y cuantificar las variaciones a nivel de expresión de proteínas entre individuos sanos y enfermos, y a su vez los cambios observados durante los diferentes estadios de la patología con el fin de descubrir biomarcadores de pronóstico o diagnóstico.

Para este tipo de estudios recomendamos la técnica de cuantificación relativa de proteínas sin marcaje (label free) por espectrometría de masas de alta resolución.  En esta técnica las proteínas de cada muestra se digieren con una enzima (tripsina generalmente). Los péptidos resultantes se analizan por cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. La identificación de las proteínas se realiza mediante los espectros de MS/MS y la cuantificación relativa se realiza según la intensidad de los péptidos en el espectro de MS. Variaciones en dichas intensidades se traducen en una variación en los niveles de la proteína que dio lugar a dicho péptido.

La validación de los potenciales biomarcadores descubiertos en la fase anterior de expresión diferencial es uno de los principales retos de la investigación biomédica. Para ello es necesario disponer de herramientas que permitan la cuantificación de manera precisa de aquellas proteínas de interés en diferentes muestras biológicas.

El servicio de Proteómica ofrece la técnica Multiple Reaction Monitoring (MRM). En esta técnica, la cuantificación se realiza a nivel de péptido por lo que primero las proteínas de cada muestra serán digeridas con una enzima (generalmente tripsina). Posteriormente los péptidos se separan en un equipo de LC y se introducen secuencialmente en el espectrómetro de masas 6500QTRAP+. Desde un punto de vista instrumental, en un análisis MRM típico el primer cuadrupolo Q1 transmite a Q2 una sola masa (m1), correspondiente al péptido tríptico completo. En Q2 se fragmenta ese péptido en fragmentos más pequeños (m2, m3, m4, etc). El tercer cuadrupolo Q3 opera de forma que sólo transmite algunos de dichos fragmentos (por ejemplo, m2, m3). Esas transiciones (m1 a m2 y m1 a m3), generan unos picos cromatográficos que, en función de su intensidad relativa, podrán cuantificar cambios a nivel de abundancia proteica. Para cuantificar puede ser necesario la compra de péptidos sintéticos marcados isotópicamente.

Podemos destacar como principales aplicaciones de la técnica de MRM:

• Validación de los biomarcadores
• Cuantificación de proteínas sin necesidad de anticuerpo
• Cuantificación de proteínas con modificaciones postraduccionales
• Cuantificación de proteínas mutadas
• Cuantificación de isoformas

La cuantificación de metabolitos es igualmente interesante en la búsqueda de biomarcadores de pronóstico o diagnóstico en biomedicina. En este caso la molécula diana no será una proteína sino una molécula pequeña.

En el Servicio de Proteómica ofrecemos la posibilidad de desarrollar y validar métodos analíticos para la cuantificación de determinados metabolitos. Posteriormente, usaremos esos métodos analíticos para cuantificar aquellos metabolitos en muestras de interés. Para ello utilizaremos la técnica de MRM explicada anteriormente y el espectrómetro de masas 6500QTRAP+ acoplado a un HPLC analítico. Para poder realizar la cuantificación será necesario la compra de los estándares de las moléculas de interés, así como sus estándares internos (normalmente la misma molécula marcada isotópicamente).

• 6500QTRAP+ (Sciex), HPLC nano/micro LC425 (Sciex) y HPLC 1200 (Agilent)
• 4800plus MALDI-TOF/TOF (Sciex)
• Software: Mascot Daemon (MatrixScience), Multiquant (Sciex) y Skyline (UW)

• Enfoque isoeléctrico: Protean IEF (Bio-Rad) (7,18 y 25 cm)
• SDS-PAGE: Protean plus dodeca (Bio-Rad), Mini-protean plus dodeca (Bio-Rad) y mini-protean (Bio-Rad)
• Densitiometer GS-800 (Bio-Rad)
• Typhoon Trio (GE)
• Odyssey CLx (Li-cor)
• Software: SameSpots (Progenesis), QuantityOne (Bio-Rad), PDQuest (Bio-Rad)
• Cortador automático de spots ExQuest (Bio-Rad)
• Digestor automático de proteínas MSI Complete (Intavis)

• Proyecto Spanish Human Proteome Project Chr 16 Consortium (SpHPP). Iniciativa englobada en el Human Proteome Project (HPP) y en la Plataforma de Recursos Biomoleculares. Programa de Proteómica (ISCIII AES-2017-PRB3).

• • Unraveling the composition of insecticidal crystal proteins in Bacillus thuringiensis: a proteomics approach. Applied Environmental Microbiology (2020) 86(12): e00476-20
  • Altered plant and nodule development and protein S-nitrosylation in Lotus japonicus mutants deficient in S-nitrosoglutathione reductases. Plant and Cell Physiology (2020) 61(1): 105–117
  • Caracterización de los cambios en el proteoma plaquetario asociados al desarrollo de cáncer colorrectal. 23º Reunión anual Asociación Española de Gastroenterología (2020)
  • A multicentric study to evaluate the use of relative retention times in targeted proteomics. Journal of Proteomics (2017) 152, 138–149
  • Identification of bitter pit protein markers in Malus domestica using differential in-gel electrophoresis (DIGE) and LC–MS/MS. Postharvest Biology and Technology  (2016) 111, 224–23.
  • The proteomic 2D-DIGE approach reveals the protein voltage-dependent anion channel 2 as a potential therapeutic target in epithelial thyroid tumours. Molecular and Cellular Endocrinology  (2015) 404, 37–45
  • Surfing Transcriptomic Landscapes. A Step beyond the Annotation of Chromosome 16 Proteome. Journal of Proteome Research. (2014), 13, 158−172.
  • Simultaneous Determination of Oxysterols, Phytosterols and Cholesterol Precursors by High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry in Serum.  Analytical Methods (2013), 5, 2249-2257
  • Proteomic profile of osteoclasts in Gaucher disease patients according to the severity of bone manifestations. World Lysosomal Symposium. 2015, Orlando, USA
  • Targeting proteins of chromosome 16. 13th Human Proteome Organization World Congress. 2014, Madrid, Spain.
  •  Disecting chromosome 16 Proteome.  13th Human Proteome Organization World Congress. 2014, Madrid, Spain.
  •  Two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) Proteomic Analysis in epithelial human thyroid carcinoma identified voltage-dependent anion channel 2 protein (VDAC2) as an apoptotic key factor. 2nd World Congress on Thyroid Cancer (2nd WCTC). 2013, Toronto, Canadá.
  • Development of SRM methods for the detection and quantification of chromosome 16 proteins. 12th Human Proteome Organization World Congress, 2013, Yokohama, Japan.